Отходы и побочные продукты деятельности в области сельского хозяйства, лесной и пищевой промышленности можно использовать в различных целях, в частности для получения энергии с одновременным увеличением биомассы и уменьшением загрязненности окружающей среды. Их также можно при помощи микроорганизмов разлагать до сбраживаемых соединений или превратить в белки тем же способом, что и насыщенные алифатические углеводороды, n-парафины (побочные продукты очистки нефти), метан или ме rанол. Культивирование водорослей в сточных водах, которое получило значительное развитие и усовершенствование, способствует не только очистке этих вод, но и получению биомассы, богатой белками и микроэлементами. Характер и масштаб процессов конверсии обусловлены как экономическими факторами, так и их соответствием социально-экономической ситуации.

Природа и количество отходов и побочных продуктов

Переработке могут подвергнуться огромные количества отходов и побочных продуктов. В табл. 10 суммированы количества побочных продуктов сельского хозяйства в нескольких европейских странах (данные 197б г.). Во Франции в 1979 г. насчитывалось 395 млн. т органических отходов (включая сельскохозяйственные отходы); в Японии ежегодно (по данным 1979 r.) остается 76,6 млн.т рисовой соломы, рисовой шелухи, древесных и других сельскохозяйственных и пищевых отходов.

Таблица 10. Количество побочных продуктов в нескольких странах Западной Европы
(по данным 1976 г.)

По данным экспертов Программы окружающей среды ООН (UNEP) за 1978 r., от различных злаков, культивируемых в мире, ежегодно получается примерно 1700 млн. т соломы, большая часть которой не используется. При сборе и обработке сахарного тростника для получения сахара ежегодно накапливается 50 млн. т верхушек стеблей и 67 млн. т выжатого сахарного тростника (жома), не считая мелассы и прессованных остатков. И хотя остаточными водами мелассы в Индонезии удобряют рисовые поля, прессованные остатки идут на удобрение почвы или как корм скоту, а жом используется в качестве топлива в давильных установках, следует признать, что все эти отходы используются недостаточно. Еще один типичный примерананас. Он принадлежит к тем многочисленным фруктам, большая часть которых идет в отходы. При консервировании используется менее 20% целого ананаса. Мякоть, кожуру и другие отходы ананаса часто давят для получения сока, а высушенные остатки скармливают крупному рогатому скоту. Спиртовое брожение может существенно снизить загрязнение воды, вызываемое сливом сиропа и стоками заводов, консервирующих ананасы.

Побочные продукты сельского хозяйства и отходы сельскохозяйственной и пищевой промышленности могут находиться на большом расстоянии от производственных единиц (солома) или группироваться вокруг них (опилки, молочная сыворотка). В первом случае стоимость переработки выше. Использование побочных продуктов или их переработка микроорганизмами зависит от того, насколько рентабелен этот процесс по сравнению с употреблением других субстратов. Необходимо также учитывать последствия для окружающей среды (будет ли загрязнение среды выше, или, напротив, переработка отходов сулит его снижение).

Электронная микрофотография среза корневого клубенька.
Внутри клубенька ризобактерии приобретают особую морфологию
(бактероиды) и часто группируются в «кучки», разделенные мембранами (М).
На фотографии можно видеть пектиноцеллюлозную стенку клетки корня (Кл. ст.).

Тi-плазмида Agrobacterium tumefaciens.
Электронная микрофотография Тi-плазмиды Agrobacterium tumefaciens,
которая индуцирует развитие опухолей в растительных тканях,
зараженных этим видом бактерий (корончатый галл).
Плазмида использовалась в экспериментах по генной инженерии
с целью переноса генов растениям.

Перенос Т-ДНК Тi-плазмиды Agrobacterium tumefaciens в растения табака.
Т-ДНК (переносимая ДНК)компонент Тi-плазмuды Agrobacterium tumefaciens,
которая может передаваться растениям, зараженным этой бактерией,
и интегрировать в геном растения; она передается по томству растений
и может быть исполыована для переноса в растения каких-либо исследуемых генов,
таких, как гены азотфиксации (nif). В эксперименте, показанном на этой фотографии,
Т-ДНК, находившаяся в бактериях на чашке Петри (слева), переносится на корни,
растущие на плотной питательной среде в чашке Петри (справа).
Из корней регенерируется целое растение, содержащее Т-ДНК.
Размножаясь половым путем, растение дает начало трансформированным растениям,
морщинистые листья которых свидетельствуют об интеграции Т-ДНК
в их генома.

Клетки пивных дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
Микрофотография S. cerevisiae, вьтолненная сканирующим
электронным микроскопом. Диаметр каждой клетки примерно 5 мкм;
одни клетки почкуются, тогда как у других имеются рубцы,
образующиеся при отделении дочерней клетки от материнской.

Электронная микрофотография почкующейся
клеmки пивных дрожжей (Sacchaюmyces cerevisiae).
Первая дочерняя клетка еще не отделилась
от исходной клетки, на которой образуется уже следующая почка.
В родительской клетке, а также в новообразованных почках
видны митохондрии с характерными для них внутренними мембранами.
Ядро (Я) видно в материнской клетке и окружено мембраной
(дрожжи являются микроскопическими эукариотическими организмами).

Митохондриальная ДНК клетки Sacchaюmyces cerevisiae.
ДНК из митохондрий S. cerevisiae представлена на этой
микрофотографии несколькими двуцепочечными кольцевыми молекулами.

Иммобилизация клеток Zymomonas mobllis на хлопковых нитях
для промышленного производства этанола. Бактерии этого вида
веками использовались в Центральной Америке длл производства
ферментируемых алкогольных напитков, в частности пульке
(его получают при сбраживании сока агавы). Zymomonas mobllis
эффективнее, чем дрожжи, сбраживают углеводы в спирт,
особенно если они иммобилизованы на твердой подложке,
такой, как хлопковые нити, переплетенные на пластиковой сетке
(в данном случае длл сканирующей электронной микрофотографии).

Клетки Bacillus brevis. Микрофотография клеток Bacillus brevis,
синтезирующих антибиотик грамицидин S,
выполненная сканирующим электронным микроскопом. х 5500.

Гифы или филаменты плесени Cephalosporium acremonium.
Эта плесень синтезирует антибиотик цефалоспорин.
Раздутые филаменты соответствуют высокопродуктивной
фазе жизни микроорганизма. х 480.

Электронная микрофотография клетки штамма ASI Methylophilus methylotrophus. х 96 000

Гранулированная форма продукта, производимого на предприятии концерна «Империал кемикал индастриз» в Биллингэме из белка одноклеточной Methylophilus methylotrophus. Рмночное название продукта-прутин.

Метановое брожение и производство биогаза.
На фотографии показана цистерна дайджестера, в которой
из различнw отходов при добавлении воды, получается биогаз.
Установка предназначена для обеспечения энергонужд
одной индийской семьи в шт. Хармна.

Создание цистерны дайджестера для производства биогаза в Китае.
Дайджестер делают из кирпичей, его отверстие постепенно сужается
без применения лесов. В центре видна труба, через которую будет заполняться емкость.

Производство биогаза.
Батарея из шести экспериментальных дайджестеров в Ла Миныре,
вблизи Версаля (Франция). Национальный институт
агрономических исследований (INRA).

Цементная кровля закопанного дайджестера емкостью 10 000 л (Китай).
Приспособления для сбора биогаза, получающегося при метановом
«брожении», находятся на круглом участке кровли дайджестера.

Производство биогаза.
Промышленные дайджестеры, для непрерывного производства биогаза
из навоза свиней в Шатийон-ан-Ванделэ, Иль-этВиллэн (Франция).

Ферментеры емкостью 6, 15 и 200л.
Ферментерм-это аппараты, в котормх вмращивают микроорганизмы
для промышленного производства различных веществ
или для лабораторных экспериментов. Сложности оборудования
диктуется необходимостью контроля состава культуральной среды
и поддержания Различных физико-химических параметров.

18 Гигантские ферментеры

Гигантские ферментеры для промышленного получения глутаминовой кислоты и лизина (ферментеры расположены на открытом воздухе).
На фотографии можно видеть 7 (из 20) идентичных цистерн на предприятии компании «Киёва хакко коzио» в Хофу (Япония), где производят аминокислоты. Ферментеры, построенные в начале 1970-х гг., считаются самыми крупными на предприятии: высота каждого из них достигает 13 м, емкость равна примерно 240 000 л. Для получения глутаминовой кислоты и лизина используют аэробный процесс. В 1980 г. выпущено 20 000 т zлутамата натрия и 10 000 т лизина.

Биотехнологические процессы, и в частности те из них, что связаны с превращением самых разнообразных органических веществ в ходе брожения и при метаболизме организмов, также вызывают химическое и биологическое загрязнение окружающей среды. Достаточно сказать, что один пивоваренный завод способен дать в день около 10⁷ л стоков с окислительным потенциалом, эквивалентным окислительному потенциалу сточных вод города с 200 000-м населением. В начале 1970-х гг. исследования, выполненные в США, установили, что ферментация-основной источник загрязнения, вызываемого фармацевтической промышленностью. Например, это характерно для промышленного производства антибиотиков (за исключением получения хлорамфеникола). Емкость используемых ферментеров достигает 400 000 л; отходы состоят из микробных клеток, определенных метаболических продуктов, а также неиспользованных компонентов культуральной среды. В стоках, остающихся от производства стрептомицина, биологический окислительный потенциал достигает 32 000 долей на миллион, что способствует сильному загрязнению водоемов, в которые их спускают.

Микробная деградация и конверсия

Побочные продукты и отходы, содержащие углеводы, можно переработать путем традиционного микробного брожения или биотехнологических процессов, относящихся к сфере промышленной микробиологии.

Например, меласса, которая служит маточным сиропом для кристаллизации сахарозы и удаляется из технологического цикла, когда концентрация сахара становится слишком низкой, обильный побочный продукт при получении сахара, содержащий помимо сахара сульфиты, карбонаты и соли кальция и магния (особенно свекловичная меласса). Однако при брожении мелассы используется не весь остаточный сахар.

Крахмал составляет около 50% сухого веса зерен злаков, картофеля и маниока. Этот имеющийся в больших количествах продукт производят главным образом из кукурузы и пшеницы, непригодной для хлебопечения, а также из картофеля. Он легко подвергается кислотному или ферментативному гидролизу, в результате чего получаются декстрины и глюкоза. Именно так эти гексозы получают для промышленности, где они используются для ферментационного производства спирта и фруктозного сиропа.

Гемицеллюлозы охватывают группу полисахаридов, связанных с целлюлозой в первичной и вторичной стенках растительных клеток. Они составляют до 10% древесной массы хвойных деревьев и 20% древесной массы лиственных деревьев. В соломе и кукурузных кочерыжках их доля превышает 30%. При гидролизе гемицеллюлоз, в частности ксиланов, образуются пентозы, главным образом ксилозы. Швейцарским исследователям, работающим в промышленной группе Шульцера, удалось экстрагировать ксилозу из сульфитных растворов, образующихся на заводах по производству древесной массы: до 80 кг ксилозы из 1 т отходов. Выход из жома сахарного тростника еще выше-порядка 120 кг ксилозы на 1 т отходов.

Сотрудники Исследовательского института солнечной энергии (SERI) в 1982 г. обнаружили анаэробную бактерию, Thermobacteroides saccharolyticum, которая при температуре выше 40° С вызывает деградацию гемицеллюлоз, содержащихся в фураже или древесных отходах. Среди полученных конечных продуктов были этанол и молочная кислота. Сейчас исследователи из SERI пытаются выделить ферменты, ответственные за разрушение гемицеллюлоз и сбраживание продуктов такой деградации.

Шнайдер из Национального исследовательского совета в Канаде и Цао из Университета Пардю независимо показали, что после превращения ксилозы в ксилулозу последняя может сбраживаться в спирт при участии Saccharomyces cerevisiae. Изомеризация ксилозы в ксилулозу осуществляется ферментом ксилозоизомеразой. При введении гена, кодирующего этот фермент, в дрожжевые клетки может происходить изомеризация альдопентоз в, альдоцетозы и последующее спиртовое брожение. С другой стороны, из ксилозы можно получить ксилит, который очень сладок и в то же время не вызывает порчи зубов.

Что касается гидролиза целлюлозы в глюкозу, то его можно провести при помощи Trichoderma reesii, целлюлаза, которой разрушает кристаллическую и нерастворимую целлюлозу. Спано с коллегами из военно-интендантской службы США (Натик, шт. Массачусетс) выделили мутант Т. reesii, который продуцирует в два-четыре раза больше целлюлазы, чем штамм дикого типа. Процесс гидролиза целлюлозы очень прост. Гриб выращивают в среде, содержащей еловую древесину и минеральные соли. Затем культура фильтруется, твердые элементы отбрасываются. Остается янтарного цвета жидкость с ферментом. Раствор вместе с измельченной бумагой помещают в реакционный чан и инкубируют при температуре 50° С и атмосферном давлении. В ходе реакции гидролиза образуется неочищенный глюкозный сироп, после чего негидролизованная целлюлоза и фермент используются повторно. Выход глюкозы составляет около 50% исходной целлюлозы. Опытная фабрика в Натике перерабатывает до 500 кг целлюлозы в месяц; ее производственную мощность (по сырью) можно увеличить до 2000 кг. Благодаря. этому процессу из 1 т старого картона или соломы после сбраживания глюкозы, полученной гидролизом целлюлозы, образуется 150 л спирта.

По мнению американских специалистов, процесс превращения отходов целлюлозы в спирт заслуживает большего внимания, чем получение спирта из крахмала кукурузы. В настоящее время в США изучаются три вида технологии. В результате работ, выполненных в лабораториях военно-интендантской службы в Натике и в Калифорнийском университете в Беркли, исследователи используют целлюлазы и гемицеллюлазы Trichoderma reesii для разложения биомассы до сахаров. Гексозы сбраживаются в спирт дрожжами, тогда как пентозы подвергаются другому типу брожения. Ферменты и неразложившаяся целлюлоза поступают в повторные циклы, а остаточный лигнин используется в качестве источника энергии для перегонки спирта. Технология, разработанная в Арканзасском университете и используемая в промышленности нефтяной компанией «Галф ойл», заключается в одновременном осахаривании целлюлозы и сбраживании сахаров, полученных путем гидролиза. Для этого к смеси целлюлозной биомассы и дрожжей добавляют раствор целлюлаз. Остающийся лигнин также используется для перегонки в качестве топлива, но пентозы не сбраживаются. Фирма «Био фьюэл индастриз» из Ричмонда намерена построить в шт. Вирджиния фабрику, на которой в 1985 г. будет производиться 500 т этилового спирта в сутки из 2500 т целлюлозных отходов посредством этой технологии и целлюлаз из Trichoderma reesii. Третий вид технологии состоит в прямом сбраживании целлюлозными бактериями гексоз и пентоз, образующихся при гидролизе целлюлозы и гемицеллюлоз. Преимущества этой технологии, разработанной в лабораториях Массачусетского технологического института, заключаются в следующем: помимо одновременной конверсии целлюлоз и пентоз в этанол происходит комбинация целлюлозного и спиртового брожения, а, кроме того, необходимая предварительная обработка субстратов сводится к минимуму.

При микробной деградации и конверсии целлюлоз и гемицеллюлоз можно получать этиловый спирт и сырье для химической промышленности (фурфурол, фенолы, крезолы). 200 000 т надлежащим образом переработанной соломы дают 50 000 т этанола и 20 000 т фурфурола. По оценкам некоторых специалистов, при микробной переработке целлюлозы можно получить до 30% нефтехимикатов. Методы генной инженерии помогут создать штаммы, которые будут лучше адаптированы к этим типам конверсии и дадут больший выход. Это позволит разработать реальную стратегию замещения, которая станет эффективной после 2000 г. (к тому времени химия углерода придет на смену нефтехимии при производстве новых биополимеров, биорастворителей и биодетергентов).

Перенос генов целлюлаз и гемицеллюлаз из Clostridium thermocellum в другие виды Clostridium позволит превращать целлюлозы и гемицеллюлозы в этиловый спирт, ацетон, бутанол, уксусную и молочную кислоты. Термофилия определенных штаммов Clostridium (при оптимальной температуре роста 6575° С) создает известные преимущества, так как стоимость перегонки этилового спирта и других растворителей уменьшится, а это сделает производственный процесс более экономичным. Исследователи из Университета Нового Южного Уэльса (Австралия) и Рутгерского университета (США) обнаружИJШ, что бактерия Zymomonas mobllis, выделяемая нз пальмового вина и мексиканского алкогольного напитка пульке, сбраживает сахара вдвое быстрее, чем дрожжи. Этот вид также подвергается геномной модификации, которая позволит разлагать целлюлозу с одновременным сбраживанием сахаров, получающихся в ходе деградации.

Микроорганизмы в качестве контроля загрязнения

Аэробные и анаэробные микроорганизмы способствуют удалению существенной части органического материала, содержащегося в сточных водах. Были получены впечатляющие результаты по переработке жидких отходов предприятий, производящих дрожжи, сидр, нефтеобрабатывающих заводов, молочных и сыроваренных предприятий, заводов по переработке картофеля на крахмал при помощи анаэробного процесса. При этом активные биологические компоненты используются в повторных циклах, уменьшается количество остаточных шлаков, в значительной степени снято распространение неприятных запахов и, что не менее важно, образуется немного метана, который служит топливом для бойлеров используемого оборудования.

Можно также выделить·микробные штаммы для контроля различных видов химического загрязнения, например деструктурирования биоцидов, биодеградация которых трудно достижима, детергентов, пластиков или углеводородов.

Так, в бактериях, относящихся к роду Pseudomonas, имеются оксиредуктазы или гидрокснлазы, способные разлагать большое число молекул углеводородов и ароматических соединений, часто высокотоксичных (бензол, толуол, ксилол). В случае некоторых штаммов Pseudamonas putida гены, кодирующие эти ферменты, находятся а составе плазмид. Известны четыре такие плазмиды: ОСТ (разложение октана, гексана и декана), XYL (разложение ксилола и толуола), САМ (разрушение камфоры) и NAH (разложение нафталина). Плазмиды САМ и NAH обеспечивают собственный перенос, индуцируя скрещивание бактериальных клеток; остальные плазмиды могут быть перенесены только в том случае, если в бактерии введены другие плазмиды, обеспечивающие скрещивание. В 1979 г. Чакрабарти (в то время совместно с компанией «Дженерал электрик») после успешных скрещиваний получил штамм, содержащий плазмиды XYL и NAH, а также гибридную плазмиду, полученную путем рекомбинации частей плазмид САМ и ОСТ (сами по себе они несовместимы, т. е. не могут сосуществовать как отдельные плазмиды в одной бактериальной клетке). Этот штамм способен быстро расти на неочищенной нефти, так как он метаболизирует углеводороды гораздо активнее, чем любой из штаммов, содержащих только одну плазмиду. Штамм может быть особенно полезен в очистных водоемах для сточных вод, где можно контролировать температуру и другие внешние факторы.

Исследования, связанные с деградацией углеводородов бактериями, в основном направлены на ускорение этого в обычных условиях очень медленного процесса. Американским исследователям удалось выделить со станций очистки сточных вод бактериальные штаммы, которые могут разлагать углеводороды и которые уже прошли мспытания в Мексиканском заливе. Исследователи из лаборатории окружающей среды Национального общества «ЭльфАкитэн» (SNEA) в По (Франция) разработали технологию ускоренного размножения живущих в море бактериальных видов, которые способны разлагать углеводороды. Для ускорения биоразложения загрязненная поверхность покрывалась микроэмульсией, содержащей инкапсулированную смесь углерода, азота и фосфора. Как оказалось, добавление этих веществ стимулировало размножение полезных бактериальных штаммов. Эксперименты, проведенные французскими исследователями в Атлантике, Средиземноморье и в районе островов Кергулен, позволили сделать следующий вывод: там, где применяли новый метод, в течение недели с загрязненной поверхности исчезало 70-90% углеводородов по сравнению с 12-20% на необработанных местах. После каждой операции плотность фитопланктона повышалась. Микроэмульсия была эффективна при концентрации 1:10, такая концентрация характерна для большинства диспергаторов, которые применяются для контроля загрязнения, вызываемого углеводородами. Преимущество биологического процесса состоит главным образом в том, что он не вызывает появления нового загрязняющего агента в окружающей среде. Новая технология найдет применение как в морях, так и в болотах и лагунах, куда нелегко добраться, а также для контроля случайных загрязнений, например, в акваториях портов.

Сейчас исследования в лабораториях. SNEA. в По направлены на разработку процесса, который смог бы обеспечить стимуляцию роста большого числа групп морских бактерий, деградирующих углеводороды.

Некоторые микробы способны изменить молекулу таким образом, что она затем разлагается под действием других микробов. Такой «кометаболизм» продемонстрировали Дафтон и Хеи (Калифорнийский университет) в случае разрушения сильного высокотоксичного инсектицида, паратиона, под действием двух штаммов Pseudomonas (Р. aeruginosa и Р. stutzeri).

Часто результатом химического превращения токсичной молекулы является не полное разложение, а детоксификация: фосфорилирование, метилирование, ацетилирование и т. д. Ферменты, катализирующие реакции детоксификации, часто кодируются генами, находящимися в составе плазмид. Келлогу, Чаттерджи и Чакрабарти из Иллинойсского университета в Чикаго удалось получить микробную культуру, способную полностью метаболизировать 2,4,5-Т (2,4,5-трихлорфеноксиуксусную кислоту), которая является сильным и широко применяемым гербицидом. Исследователи выделили на очистных станциях несколько микроорганизмов и смешали их с другими бактериальными штаммами, содержащими ряд плазмид с генами, кодирующими ферменты разложения органических соединений (толуола, ксилола), хлорпроизводных (4-хлоркатехола) и салицилатов. Затем смесь бактерий выращивали в хемостате исключительно на 2,4,5-Т. После 10 мес. культивирования в этих условиях скорость роста бактерий значительно повысилась в связи с тем, что 2,4,5-Т начала использоваться для роста бактерий даже в случае очень высокой концентрации (1,5 мг/мл) в течение нескольких дней. В настоящее время исследователи пытаются выделить отдельный штамм, содержащий плазмиды с генами всех ферментов, ответственных за разные стадии разрушения 2,4,5-Т.

Методы генной инженерии должны сделать достижение такого результата возможным. Это позволит затем решить проблему конструирования микробных штаммов, способных разрушать и ассимилировать множество соединений, часто не подверженных биоразложению (или ксенобиотиков), которые, в частности, производятся химической промышленностью.