Клеточная селекция и сомаклональная вариабельность

Изучение растений сомаклональных вариантов показало, что от растения-донора они отличаются не только моногенными качественными признаками, но и (что более важно практически) количественными полигенными признаками, такими, как интенсивность роста, продуктивность, толерантность к неблагоприятным факторам окружающей среды (абиотические и биотические). Отмечены случаи появления сомаклональных вариантов, сочетающих признаки, которые невозможно или трудно соединить в одном генотипе методами традиционной селекции. Например, J1. Кучеренко (1986) отселектировала из сомаклональных вариантов, образовавшихся в каллусной ткани риса, растения, сочетающие скороспелость и длиннозерность. На их основе за короткий срок был создан новый сорт риса, названный Биориза, в Китае на основе сомаклонов – сорт риса, сочетающий скороспелость и устойчивость к пониженным температурам.

Практические результаты по использованию сомаклональных вариантов впервые были получены у сахарного тростника в начале 70-х годов XX столетия на Гавайских островах. Среди регенерантов были отобраны растения, устойчивые к вирусам мучнистой росы. В результате получены различные формы сахарного тростника, устойчивые к болезням и с повышенным содержанием сахара до 20 %.

Из длительно культивируемых каллусных тканей герани получены растения-регенеранты с измененной морфологией листовых пластинок и цветков, атакже с измененным составом эфирныхмасел.

В нашей стране успешно развиваются работы по получению и оценке сомаклональных вариантов картофеля (ВНИИ картофельного хозяйства, JI. Хромова и др.). Из большого числа линий, полученных из каллусной ткани двух изучаемых сортов картофеля отобраны и проверены в полевых условиях на стабильность те, которые обладают хозяйственно важными признаками, корректирующими отдельные недостатки исходного сорта. Так, после трехлетних полевых испытаний сомаклонов сорта Любимец удалось выделить линии, превосходящие сорт по урожайности, устойчивости к фитофторе и степени устойчивости к вирусам.

В Украинском ВНИИ картофельного хозяйства (А.А. Кучко и др., 1987) уделяется значительное внимание протоклонам – растениям, полученным из каллусной ткани, индуцируемой из протопластов, – которые по отдельным хозяйственно-ценным признакам превосходят исходные сорта. Полученные растения включены в конкурсное сортоиспытание этого института.

Создание сомаклонов имеет несомненное значение для селекции зерновых культур, где традиционными методами создаются сорта на узкой наследственной основе. Анализ сомаклонов, полученных разными группами исследователей из каллусной ткани сортов озимой и яровой пшеницы (Т. aestivum), показал большую изменчивость среди сомаклонов и отличие их от исходного сорта по таким морфологическим признакам, как высота растения, интенсивность кущения и число побегов, отношение колоса к соломине, остистость или безостость колоса, его форма, окраска семян. По физиологическим признакам растения различались по времени вегетации, устойчивости к низким температурам и условиям перезимовывания и устойчивости к болезням (Р.Г. Бутенко, И.Д. Никифорова, 1988).

Соматическая гибридизация

Гибридизация соматических клеток методом слияния протопластов, без сомнения, обогатила клеточную биологию. Появилась возможность изучать поведение гибридных ядерных геномов при разной степени таксономической удаленности партнеров. Межродовая соматическая гибридизация между картофелем (S. tuberosum) и томатом (Lycopersicon esculentum) позволила Д. Мельхерсу с сотр. (1978) получить гибридные растения двух типов, которые авторы назвали «томато» и «помато», в зависимости от родовой характеристики хлоропластов гибрида. В первом случае хлоропласты были томатные, во втором – картофельные. Эти растения не обладали хозяйственно-полезными свойствами, но позволили наблюдать проявление признаков партнеров.

Ю.Ю. Глеба и Ф. Хоффман (1979) получили еще более отдаленный межтрибный гибрид методом слияния изолированных протопластов из каллусных клеток арабидопсиса (A. thalianа) и мезофилла листа турнепса (Brassica compestris). Цитологический и биохимический анализ подтвердил гибридную природу шести изученных клеточных клонов. Хромосомы обоих партнеров долгое время сохранялись без элиминации. В трех клонах авторы наблюдали стеблевой органогенез и появление уродливых пробирочных растений. Хромосомный анализ подтвердил их гибридный характер. Эти гибридные уродливые растения не цвели и не образовывали нормальных корней. В некоторых линиях, где большинство хромосом турнепса элиминировалось при субкультивировании, возникали более нормальные, похожие на арабидопсис растения, при сохранении хлоропластного генома турнепса. Для доказательства того, что полученные растения являются истинными ядерными гибридами, авторы обычно изучают морфологические признаки, состав полипептидов малой субъединицы рибулезо-бис-фосфаткарбоксилазы, кодируемой ядерными генами, проводят изозимный анализ, рестриктный анализ митохондриальной и хлоропластной ДНК применяют для определения того, какие цитоплазматические геномы унаследованы соматическим гибридом от партнеров по слиянию.

При межвидовой соматической гибридизации могут возникнуть как стерильные (Z. pennelii, S. melongena + S. tisymrifolium), так и фертильные (S. tuberosum + S. chacoertse, S. tuberosum + S. brevidens) растения. В последнем случае возникает возможность получить потомство от самоопыления или обратного скрещивания с культурными сортами. Последнее важно, так как часто у гибридов, например между сортами картофеля и дикими видами, преобладает признаки последних.

Соматический гибрид между S. tuberosum сорт Приекульский ранний и S. chacoense, полученный в 1979 г. (Р.Г. Бутенко, Кучко, 1979), имел ряд хозяйственно важных признаков. Была сделана попытка вовлечь его в практическую селекционную работу. Однако длительный процесс беккроссирования не позволил получить формы, в которых полностью отсутствовали признаки дикаря, хотя после восьми беккроссов был получен гибрид, несущий полевую устойчивость к Y-вирусу и хорошую продуктивность.

Гаплоидная селекция

Методом культуры пыльников в разных странах созданы высокоурожайные и устойчивые сорта риса (170 000 га) и пшеницы (70 000 га) – Китай. В Краснодаре этим же методом получены различные сорта риса, табака. В Поволжье с успехом применялся ячмень и тритикале. В разных центрах России с успехом был применен метод «Бульбозум» (bulbosum). Для этого использовали H.bulbosum (дикий ячмень). Хромосомы гибридного зародыша Fi и F₂ скрещивали с определенными формами H.bulbosum. При оплодотворении яйцеклетки H.vulgare пыльцой H.bulbosum отцовские хромосомы илиминируются и развивается гаплоидный зародыш. Нормальное развитие при этом тормозится, и выращивание происходит in vitro. Гибридные проростки отбраковываются, а гаплоидные обрабатываются колхицином для удвоения числа хромосом.

В Канаде так созданы новые сорта ячменя. В Одессе вместо 10–12 лет получены этим же методом С. Лукьянюк и С. Игнатовой (1983) сорта ячменя за 4–5 лет. При использовании метода «Бульбозум» эффективность получения негаплоидных растений невелика, растения альбиносы не возникают. Этим же методом можно получить изогенные линии пшеницы, но для других видов злаков преимущество bulbosum не отмечалось.

Широкому использованию техники получения гаплоидов в культуре пыльников мешает низкая эффективность, которую можно расчитать как: 1) процент изолированных пыльников, образовавших в культуре эмбриоидов или каллус из микроспор, 2) процент гаплоидных растений-регенерантов в расчете на изолированный пыльник. Недостатком метода является также появление в большом числе (особенно у злаков) альбиносных растений-регенерантов (Р.Г. Бутенко, 1999). Таким образом, создание гаплоидных растений разными методами in vitro позволяет быстро создать гомозиготные линии – и в этом ценность данной технологии для селекции. Некоторый скептицизм, проявляемый селекционерами, связан в частности с тем, что при использовании Fi поколения рекомбинации могут произойти только в одном мейотическом цикле, этого недостаточно для обмена признаками, контролируемыми полигенно. Как выход предлагается или использование F₂ поколения или половая гибридизация полученных in vitro регенерантов разных генотипов и повторный цикл получения гаплоидов in vitro у отселектированных половых гибридов.

Клональное микроразмноженне растений

Во многих странах мира биоиндустрия микроклонального размножения поставлена на поточную промышленную основу и представлена десятками активно функционирующих предприятий. Например, во Франции 94 % всей продукции цветочных культур получают методом культуры изолированных тканей. В США около 100 коммерческих предприятий получают посадочный материал декоративных, овощных, полевых, плодовых и лесных культур методом клонального микроразмножения. Ведущим производителем оздоровленного посадочного материала цветочных растений является Голландия, а подвоев яблони, сливы и персика – Италия (до 250–500 тыс. ежегодно). В нашей стране также ведутся интенсивные работы по клональному микроразмножению растений, и в настоящее время многие научно-исследовательские институты и промышленные лаборатории разрабатывают и усовершенствуют методы микроразмножения и оздоровления различных декоративных, плодовых, ягодных, овощных, кормовых и древесных культур. Например, методы ускоренного размножения винограда, разработанные во Всесоюзном научно-исследовательском институте виноделия и виноградарства «Магарач», позволяют получать из одного одноглазкового черенка 8 тыс. растений в течение четырех месяцев. Оздоровление промышленных посадок малины от комплекса вирусных заболеваний путем сочетания термотерапии и культуры меристемы повышает продуктивность культуры в 6–8 раз. Размножение и получение безвирусного посадочного материала гвоздики, хризантемы, антуриума Андре, розы, бегонии Элатиор и других ведется в специализированных цветоводческих хозяйствах «Элита» Российской Федерации и в меристематическом комплексе Республиканского концерна «Крымзеленстрой».

Криоконсервация

Базовые коллекции – криобанки – обеспечивают практически вечное хранение растительного материала; значительную экономию затрат по сравнению с обычными коллекциями и даже депонированными; гарантируют не только сохранность образца, но и сохранение всех его свойств без исключения; сохранение столь важной и значительной по объему части их генотипа, как блоки генов, отвечающие за рост культуры, пролиферацию клеток и биосинтез вторичных соединений, синтезируемых исходным растением и интересующих промышленность (табл. 3.11 и 3.12).

Таблица 3.11. Клеточные штаммы растений, постоянно хранящиеся
в крнобанке ИФРА РАН в жидком азоте (-196'Q (Р.Г. Бутенко, 1999)

Клеточные штаммы (ИФР РАН), регенерировавшие растения после хранения в жцкком азоте
Dioscorea balcanica (органогенная каллусная ткань)
Dioscorea caucasica (органогенная каллусная ткань)
Solanum tuberosum (cv.Tava) КТ-4
Daucus carota М-34

Клеточные штаммы (ИФР РАН), спорадически возобновлявшие рост после замораживания до жнккого азота
Rauwolfia serpentina R-III
Digitalis lanata I (наперстянка шерстистая)
VII (наперстянка шерстистая) эмбриоиды
Panax japonicus (женьшень японский) Ж7
Rhaponticum carthamoides Rhs-8
Polyscias filicifolia ПП-1

Меристемы (ИФР РАН), возобновившие рост и регенерировавшие растения после хранения в жидком азоте
Fragaria х ananassa (земляника садовая) 23 сорта
Solanum tuberosum (картофель) 9 сортов
Rubus idaeus (малина) 1 сорт
Ripes nigrum (черная смородина) 1 сорт
Digitalis lanata (наперстянка шерстистая)
Chamomila recutita (ромашка лекарственная)

Таблица 3.12. Криоконсервация меристематических верхушек земляники и малины (О.Н. Высоцкая, 1997)