В культуральной жидкости после окончания процесса ферментации содержатся микроорганизмы, продукты их жизнедеятельности, остатки питательной среды, пеногаситель, растворимые и нерастворимые вещества. Целевым продуктом биосинтеза могут быть непосредственно сами микроорганизмы либо их метаболиты, растворенные в культуральной жидкости или находящиеся внутри клеток микроорганизмов.

Почти во всех случаях для получения целевого продукта необходимо отделить взвешенную фазу – массу микроорганизмов – от культуральной жидкости.

Культуральные жидкости обычно являются сложными смесями и содержат большое число компонентов, многие из которых обладают^ близкими физико-химическими свойствами.

Наряду с растворенными минеральными солями, углеводами, белками и другими органическими веществами культуральные жидкости содержат в значительном количестве полидисперсные коллоидные частицы и взвеси. Следовательно, они являются не только многокомпонентными растворами, но и суспензиями. Дисперсная фаза этих суспензий состоит из мицелия или клеток микроорганизмов, а также из твердых частиц, содержащихся во многих питательных средах, – муки, хлопьев из кукурузного экстракта и т. п.

Содержание микроорганизмов в культуральной жидкости, как правило, очень низкое. В 1 л содержится обычно 5–10 г сухой биомассы. Отделение такого количества взвешенной фазы – трудная технологическая задача, которую приходится решать путем концентрирования биомассы различными способами (флотирование, сепарирование, упаривание). В производственных условиях приходится затрачивать значительное количество энергии на обработку больших объемов труднофильтруемых суспензий.

Способы отделения клеточной биомассы микроорганизмов от культуральной жидкости можно разделить на механические (отстаивание, фильтрование, центрифугирование) и теплотехнические (сушка).

В зависимости от конечной цели выбирают различные сочетания л их способов. При выборе схемы концентрирования и извлечения биомассы предварительно оценивают экономичность выбранного способа с учетом товарной формы биопрепаратов, концентрации микроорганизмов в культуральной жидкости и др.

Большинство целевых продуктов микробиологического синтеза нестабильны и подвержены влиянию различных факторов. Белки, например, исключительно чувствительны к нагреванию, изменению рН среды, к многим физическим и химическим воздействиям. Очень часто выделить целевой продукт одним методом практически невозможно, поэтому применяют комбинацию нескольких методов.

Выделение и концентрирование микроорганизмов
и продуктов микробного синтеза

При выборе метода выделения и концентрирования того или иного продукта микробиологического синтеза необходимо учитывать следующие факторы: физико-химические свойства культуральной жидкости; свойства выделяемого продукта (термолабильность, стойкость к различным химическим агентам и др.); требования к конечной форме продукта (степень чистоты и концентрирования); технологические и технико-экономические показатели (выход продукта, производительность оборудования, необходимость дальнейшей обработки и др.).

Все методы выделения продуктов микробиологического синтеза из культуральной жидкости делят на две группы:

1) экстракция, ионный обмен, адсорбция, кристаллизация, если целевой продукт в растворе;
2) осаждение, фильтрование, центрифугирование, сепарирование, если целевой продукт в виде твердой фазы.

Часто невозможно выделить целевой продукт при помощи одного метода, тогда применяют комбинацию нескольких методов и в процессе выделения переводят продукт из растворимой формы в нерастворимую (или наоборот). Как правило, при выделении растворенных веществ культуральную жидкость подвергают предварительной обработке и очистке при помощи осаждения, фильтрования, центрифугирования, сепарирования и мембранных методов (электродиализ, ультра- и микрофильтрация).

Осаждение (седиментация) – это процесс расслоения дисперсных систем под действием силы тяжести и отделение дисперсной фазы в виде осадка. Простейший случай седиментации – отстаивание применяют в следующих случаях:

1) при диаметре частиц более 3 мкм, когда броуновское движение не оказывает существенного влияния на процесс отстаивания;
2) при выделении стабильных продуктов, когда фактор времени не имеет решающего значения;
3) при более низких, чем при других методах, затратах;
4) в особых случаях, когда необходимо разделить частицы на фракции по размеру или плотности на основании их различных скоростей осаждения;
5) если необходимо предварительно разделить суспензию на две фракции – осадок и надосадочную жидкость, которые в дальнейшем можно обрабатывать на различном оборудовании.

Скорость осаждения биомассы из культуральной жидкости невелика и составляет порядка 10^–6–10^–7 м/с.

Дня ускорения процесса осаждения применяют:

1) коагулянты – вещества, переводящие взвешенные частицы в агрегатно-неустойчивое состояние;
2) флокулянты – вещества, способствующие разрушению коллоидных структур и образованию крупных хлопьев.

В качестве коагулянтов применяют обычно желатин, рыбный клей, казеин, в качестве флокулянтов – метил целлюлозу, пектин, альгинат натрия и др.

Центрифугирование

Это разделение неоднородных систем под воздействием поля центробежных сил. Для центрифугирования применяют центрифуги различных конструкций.

Центрифуги, имеющие высокий фактор разделения и оснащенные тарельчатым барабаном, называют сепараторами. В микробиологической промышленности сепараторы являются одним из самых распространенных типов центрифуг. Они позволяют сконцентрировать осадок до влажности 60–90 %.

В последние годы появились специальные герметичные сепараторы, позволяющие вести процесс сепарирования в автоматизированном режиме, оптимально подобранном для специфических условий конкретных культуральных жидкостей.

Области применения центрифугирования:

1) выделение биомассы из культуральной жидкости (дрожжи, бактерии, грибы);

2) отделение различных целевых продуктов микробиологического синтеза (антибиотики, ферменты, витамины и др.), переведенных предварительно в твердую фазу;

3) разделение эмульсий, образующихся при экстракции.

Главные достоинства центрифугирования и сепарирования –

высокая производительность и высокая степень концентрирования – позволяют успешно конкурировать с другими способами выделения и концентрирования как в промышленных, так и в лабораторных условиях.

Фильтрование

Это разделение твердой и жидкой фаз суспензии при пропускании ее через пористую перегородку.

Конечная цель фильтрования – получение твердой или жидкой фазы (когда одна из них является отходом), а также одновременное получение твердой и жидкой фаз.

Фильтрование – гидродинамический процесс, скорость которого прямо пропорциональна разности давлений, создаваемой по обеим сторонам фильтровальной перегородки, и обратно пропорциональна сопротивлению, испытываемому жидкостью при ее движении через поры перегородки и слой образовавшегося осадка.

На процесс фильтрования влияет ряд факторов, которые можно разделить на две группы:

1) макрофакторы – разность давлений, толщина слоя осадка, вязкость жидкой фазы и др. – заведомо известны и контролируются приборами;
2) микрофакторы – размер и форма частиц осадка и пор фильтровальной перегородки, толщина двойного электрического слоя на поверхности частиц и др. – менее изучены и их характеризуют лишь косвенными методами. Именно микрофакторы оказывают решающее влияние на процесс фильтрования и затрудняют его масштабирование.

При фильтровании культуральной жидкости образуются большей частью студенистые хлопьевидные или мелкозернистые осадки, обладающие большим сопротивлением. Средняя скорость фильтрации при этом составляет всего 50 л/м² в час.

Для увеличения скорости фильтрования обычно используют два приема: предварительная обработка суспензий; применение вспомогательных фильтровальных материалов.

Предварительная обработка культуральной жидкости позволяет более полно перевести целевой продукт в жидкую или твердую фазу, обеспечить лучшее разделение фаз и получить продукт, годный для дальнейшей очистки и выделения. В результате предварительной обработки происходит коагуляция взвешенных частиц.

Наиболее распространены следующие способы предварительной обработки:

1) кислотная коагуляция (применяется для выделения антибиотиков, стойких к низким рН);

2) обработка электролитами;

3) тепловая коагуляция (возможна в тех случаях, когда продукт стоек к нагреванию до 70–80 °С);

4) образование наполнителей при добавлении химических агентов.

В качестве вспомогательных фильтровальных материалов используются фильтровальные порошки, которые вносят в фильтруемую жидкость как наполнители или предварительно наносят на рабочую поверхность фильтра в виде фунтового слоя.

Экстракция

Процесс разделения смеси твердых и жидких веществ при помощи избирательных (селективных) растворителей. Физическая сущность экстракции состоит в переходе извлекаемого компонента из одной фазы (жидкой или твердой) в фазу жидкого экстрагента при их взаимном соприкосновении. Экстрагируемые компоненты переходят из исходного раствора в растворитель вследствие разности концентраций, поэтому данный процесс относится к числу диффузионных.

Процесс экстракции проводится обычно в двухфазных системах: твердое тело – жидкость или жидкость – жидкость.

Область применения экстракции: выделение и очистка антибиотиков, витаминов и аминокислот.

Ионообмен

Представляет собой сорбционный процесс.

Адсорбция

Это процесс поглощения одного или нескольких компонентов целевого продукта из газовой смеси или раствора твердым веществом – адсорбентом.

Процессы адсорбции (как и другие процессы массопередачи) избирательны и обычно обратимы. Благодаря этому становится возможным выделение поглощенных веществ из адсорбента, т. е. проведение процесса десорбции.

Первые сорбционные методы выделения и очистки биологически активных веществ и антибиотиков были основаны на применении молекулярных сорбентов (активированные угли, оксид алюминия и др.). Молекулярные сорбенты одинаково хорошо сорбируют выделяемое вещество и ряд примесей.

В настоящее время разработаны ионообменные сорбенты (иониты), которые характеризуются различной избирательностью и высокой специфичностью.

Иониты – это органические и неорганические вещества, практически нерастворимые в воде и обычных растворителях, которые содержат активные (ионогенные) группы с подвижными ионами, способные обменивать эти ионы на ионы электролитов при контакте с их растворами.

Наиболее перспективны синтетические ионообменные смолы (КУ-2, КБ-4, КБ-ЧП-2, КМД, АВ-17, ЭДЭ-10 и др.).

В зависимости от наличия ионогенных групп иониты можно разделить на два основных класса:

1) ионообменные сорбенты, содержащие кислотные группы – катиониты (нерастворимые кислоты);

2) ионообменные сорбенты, содержащие основные группы – аниониты (нерастворимые основания).

Иониты нашли широкое применение в технологии производства антибиотиков на этапе их сорбции из культуральной жидкости.

Кристаллизация

Это выделение твердой фазы в виде кристаллов главным образом из растворов и расплавов. Кристаллизация антибиотиков и других биологически активных веществ основана на резком уменьшении их растворимости в результате изменения температуры раствора (обычно понижения, но иногда, например, в случае эритромицина – повышения) или перевода их в другую плохо растворимую химическую форму. Последнее достигается изменением рН раствора или добавлением соответствующего реагента, часто с одновременным снижением температуры.

Кристаллизация является не только способом получения антибиотиков в твердом виде, но и очень эффективным средством очистки от сопутствующих примесей, что является существенным преимуществом по сравнению с некоторыми другими методами разделения.

Метод кристаллизации нашел применение в технологии получения антибиотиков (тетрациклина, эритромицина и др.), витаминов, полисахаридов.

Упаривание

Это процесс концентрирования жидких растворов путем частичного удаления растворителя испарением при нагревании жидкости. В ряде случаев упаренный раствор подвергают последующей кристаллизации.

Концентрированные растворы и твердые вещества, получаемые в результате упаривания, легче и дешевле перерабатывать, хранить и транспортировать.

Обычно упаривание в производстве антибиотиков осуществляют при 60–70 °С под вакуумом, поэтому данный метод недопустим при переработке термолабильных биологически активных веществ.

Мембранные методы разделения

К мембранным методам разделения относятся диализ и электродиализ; обратный осмос; микрофильтрация; ультрафильтрация. В основе этих методов лежит явление осмоса – диффузия растворенных веществ через полупроницаемую перегородку, представляющую собой мембрану с большим количеством (до 10¹⁰ –10¹² на 1 м²) мелких отверстий – пор, диаметр которых не превышает 0,5 мкм.

Под мембраной принято понимать высокопористую или беспористую плоскую или трубчатую перегородку, выполненную из полимерных или неорганических материалов и способную эффективно разделять частицы различных видов (ионы, молекулы, макромолекулы и коллоидные частицы), находящиеся в смеси или растворе. Использование мембран позволяет создавать экономически высокоэффективные и малоотходные технологии.

Среди мембранных процессов особенно интенсивно развиваются баромембранные. Если обратный осмос изучен достаточно полно, то существенно в меньшей мере это касается микрофильтрации и тем более ультрафильтрации, несмотря на ее очевидную перспективность. Границы баромембранных методов разделения четко не определены, что, по-видимому, принципиально невозможно, поскольку микро- и ультрафильтрация и обратный осмос в широких пределах перекрываются как в отношении их физико-химического описания, так и решаемых задач. Следовательно, приведенная классификация барометрических методов разделения в значительной мере условна. Тем не менее каждый из указанных методов имеет свои характерные особенности, на основании которых предложено несколько их классификаций.

Микрофильтрация, в основном, является гидродинамическим процессом, близким к обычной фильтрации. Специфическая особенность микрофильтрации – использование мембран с диаметром пор от 0,1 до 10 мкм для отделения мелких частиц твердой фазы, в том числе микроорганизмов, в этом случае ее называют стерилизующей фильтрацией. Поэтому в отличие от процесса фильтрации при микрофильтрации явления диффузии (особенно при небольших размерах пор от 0,1 до 0,5 мкм) также играют определенную роль.

В основе ультрафильтрации лежит использование мембран с диаметром пор от 0,001 до 0,1 мкм. Ультрафильтрация применяется для разделения клеток и молекул.

Мембранные методы разделения, применительно к биологическим суспензиям, обладают рядом преимуществ:

1) концентрирование и очистка осуществляются без изменения агрегатного состояния и фазовых превращений;
2) перерабатываемый продукт не подвергается тепловым и химическим воздействиям;
3) механическое и аэродинамическое воздействие на биологический материал незначительно;
4) легко обеспечиваются герметичность и асептические условия;
5) аппаратурное оформление компактно по конструкции, отсутствуют движущиеся детали;
6) процесс не обладает высокой энергоемкостью, в большинстве случаев энергия затрачивается только на перекачивание растворов.

Высушивание микроорганизмов
и продуктов микробного синтеза

Необходимость стабилизации материалов биологического происхождения, связанная с их чрезвычайной нестойкостью, возникла на заре биологической науки. Известно, что в обычных условиях продолжительность сохранения большинства биологических продуктов исчисляется несколькими днями. В связи с этим разрабатывались различные способы консервирования биологических препаратов, которые в настоящее время можно разделить на:

• консервирование при положительных температурах при помощи химических соединений (хлороформ, фенол, глицерин, формалин и т. д.);
• консервирование при низких температурах (замораживание);
• консервирование высушиванием.

Высушивание является одним из наиболее совершенных процессов стабилизации свойств продуктов биологического (растительного, животного, микробиологического) происхождения и позволяет сохранять данные продукты в обычных условиях длительное время. Кроме того, существенно уменьшенная масса позволяет значительно снизить транспортные расходы и затраты на тару.

Необходимо отметить, что обезвоживание – трудный технологический процесс, который часто является решающим этапом производства, влияющим на качество выпускаемой продукции. Достоинством искусственного высушивания являются значительно меньшие затраты времени на удаление влаги. Процесс сушки – это разнообразный комплекс тепловых, диффузионных, часто биологических и химических явлений (особенно, когда дело касается интенсивной сушки). Препараты биологического происхождения обычно представляют собой сложные объекты сушки, характеризующиеся рядом показателей, важнейшими из которых являются начальная, конечная и равновесная влажность, термические, электрофизические, структурно-механические и массообменные характеристики. Разнообразие свойств продуктов требует индивидуального подхода к разработке рациональных методов их сушки (с учетом требований к качеству готового изделия).

Устойчивость термолабильных препаратов
биологического происхождения к факторам высушивания

Исходя из свойств материалов биологического происхождения необходимо выбирать оптимальные режимы высушивания с учетом допустимой температуры нагрева материала, т. е. температуры, при которой высушенный продукт получается стандартного качества и обладает наилучшими технологическими свойствами.

Основными характеристиками термолабильных материалов микробиологического, растительного и животного происхождения как объектов сушки являются:

• термостойкость – способность материала противостоять нагреву до температуры, при которой происходит необратимое изменение его качества (разрушение физической или химической структуры);
• термостабильность – способность материала длительное время выдерживать нагревание при определенной температуре без изменения свойств продукта (без его разложения).

Материалы нетермостойкие и нетермостабильные
в общем случае называют термолабильными

Различная природа объектов сушки обусловила выбор диапазонов температур и экспозиций нагрева с учетом максимального сохранения числа жизнеспособных микроорганизмов и биологической активности продуктов.

Известно, что для вегетативных культур микроорганизмов термостойкость определяется в пределах 40–60 °С, а для спорообразующих форм бактерий, антибиотиков и аминокислот – в диапазоне 80– 200 °С, дальнейшее повышение температуры ведет к полной инактивации клеток.

Антибиотики и спорообразующие микроорганизмы при сравнительно мягком температурном режиме (110 °С) в течение первых 30 с сохраняют активность на уровне 100 %, увеличение длительности до 60 с приводит к понижению активности на 25–40 %, за 15 мин нагрева при той же температуре активность падает на 60–65 %. В то же время кратковременный нагрев позволяет сохранить высокую активность вещества (до 90 %) даже при 150 °С, правда при этой температуре резче проявляется отрицательное влияние продолжительности нагрева.

Вегетативные бактерии при 40 °С сохраняют практически 100 % жизнеспособных клеток. Повышение температуры до 60 °С и кратковременный контакте теплоносителем (15 с) приводит почти к полной гибели микроорганизмов (выживаемость не более 6–7 %).

Термостойкость микроорганизмов и клеток зависит от ряда внешних и внутренних факторов, состава среды выращивания, температуры нагрева, влажности и кислотности среды, возраста культуры и особенностей химического состава клеток, условий ферментации и пр. Так, предполагается, что температура роста некоторым образом влияет на физико-химические свойства клетки, изменяя ее стойкость к нагреву.

Одним из важнейших факторов, влияющих на термоустойчивость микроорганизмов, являются содержание и состояние внутриклеточной воды. Экспериментально показано, что различие в термостойкости спор и вегетативных клеток связано, в первую очередь, не с количеством воды, а с состоянием, в котором она находится или, иными словами, с формой связи воды с твердым веществом. Уменьшение свободной влаги в спорах предотвращает коагуляцию белка и способствует повышению термоустойчивости спор. Но вместе с тем при чрезмерном обезвоживании происходит дегидрационная инактивация микроорганизмов и клеток, жизнеспособность при этом сохраняют наиболее выносливые.

Помимо пагубного воздействия на клетку высоких положительных температур резкое охлаждение также ведет к гибели биологических систем. У большинства клеток наступает «температурный шок», который ведет к необратимым структурным изменениям. Механизм воздействия «температурного шока» в результате быстрого и сверхбыстрого охлаждения большинство исследователей объясняют быстрыми физико-химическими, структурными и физиологическими изменениями, возникающими в замораживаемом продукте. Эти изменения сопровождаются увеличением концентрации солей, повышением осмотического давления и кристаллизацией воды внутри клеток. Влияние данных факторов ведет к механическому повреждению клеток и денатурации белка. Избежать температурного шока можно путем медленного снижения температуры, что ослабляет интенсивность изменения осмотического давления вследствие диффузии воды и кристаллизации ее в межклеточных пространствах. Это явление называют холодовой адаптацией.

В процессе обезвоживания помимо температуры на микроорганизмы оказывает воздействие давление. Экспериментально показано, что биологические препараты сохраняют жизнеспособность как при избыточном давлении, так и в глубоком вакууме. Поэтому данный фактор при сушке термолабильных препаратов не играет существенной роли, так как давление (вакуум), создаваемое современными сушильными установками, на порядок ниже величины, при которой происходит гибель микроорганизмов. Для снижения влияния негативных факторов обезвоживания на жизнеспособность клеток и микроорганизмов разрабатывают для каждого из объектов сушки защитные среды. Защитные среды обычно представляют собой водные растворы, содержащие углевод, коллоид, окислитель и т. п. В качестве углеводов используют полисахара (лактоза, галактоза и т. д.), которые не принимают участия в метаболизме данного объекта и в процессе сушки противостоят денатурации белка, замещая ОН-группу удаляемой воды. Коллоид, которым является высокомолекулярное вещество (желатин, полиглюкин и т. д.), создает структуру высушиваемого вещества и регулирует скорость удаления влаги.

Антиокислитель (аскорбиновая кислота, тиомочевина) блокирует запуск окислительно-восстановительных реакций, возникающих в процессе удаления влаги.

Следовательно, помимо отработки режимов процесса сушки проводят и отработку оптимального состава среды высушивания, приемлемого для данного объекта.

В настоящее время различают естественную сушку на открытом воздухе и искусственную, в специальных устройствах с организованным и регулируемым подводом сушильного агента. По мнению ряда авторов наиболее широкое внедрение на практике получили следующие методы сушки: лиофильный (сублимационный); конвективный; контактный; терморадиационный; токами высокой частоты; комбинированный.

Одним из основных методов консервирования биопрепаратов, позволяющих длительное время сохранять их активность, является метод лиофильного высушивания. Он позволяет сохранить практически без изменения первоначальные свойства живых и реже инактивированных вакцин – диагностических и лечебных сывороток, антигенов и других биологически активных препаратов, используемых для профилактики, диагностики и лечения.

Лиофильное высушивание состоит из двух приемов консервирования – замораживания и высушивания. Влагу из замороженных препаратов удаляют с использованием глубокого вакуума, минуя жидкую фазу. В процессе сушки влага перемещается в препарате не в виде жидкости, а в виде пара. В результате удается максимально сохранить специфические свойства белков, свести к минимуму их денатурацию, обеспечить живым клеткам и вирусам состояние длительного анабиоза, что позволяет получить стандартизированные по активности биопрепараты.

Консервирование биопрепаратов методом лиофильного высушивания имеет ряд преимуществ перед другими методами: снижается масса биопрепарата; длительное время сохраняется исходная активность (вакцин – до 12–18 мес, сывороток – до 2–3 лет); прекращается рост микробных контаминантов; высушенные препараты можно хранить при 4–8 °С, допускается кратковременное повышение температуры до 10–15 °С (на период транспортировки до 7 дней).

Для лиофилизации биопрепаратов используют промышленные и лабораторные аппараты. Из промышленных установок получили распространение МАС-50, KS-30 (Чехословакия) и TG-50 (Германия), из лабораторных TG-2, TG-10, TG-16 (Германия), ОЕ-960, ОЕ-950 (Венгрия), LZ-45, LZ-90, LZ-92 (Чехословакия) и др. Эти установки комплектуются холодильными и вакуумными агрегатами.

Технологический процесслиофилизации включает ряд этапов.

1. Подготовка материала для сушки и выбор соответствующего криопротектора (компонентов среды высушивания).
2. Подготовка аппарата для высушивания (охлаждение рассола).
3. Предварительное охлаждение препарата, подлежащего сушке, после расфасовки в ампулы или флаконы. Определение эвтектических температур.
4. Сублимация и досушивание препарата при подогреве. Замораживание и высушивание осуществляются по установленным режимам.
5. Вакуумная или обычная укупорка после сушки, т. е. создание условий для длительного хранения сухих препаратов.
6. Определение активности, стерильности или наличия посторонних контаминантов, остаточной влажности и другие показатели согласно техническим условиям.

При замораживании биопрепаратов изменяются осмотическое давление и концентрация водородных ионов, что может привести к повреждению клеточных биомембран. Вещества, снижающие или предотвращающие эти повреждения, были названы «криопротекторы» и первоначально использовались для длительного хранения музейных штаммов микроорганизмов. Они были подобраны эмпирически и являются предметом изучения криобиологии, т. е. науки об использовании пониженных температур в биологических исследованиях и влиянии низких температур на живые системы, выяснении причин устойчивости организмов к переохлаждению и замерзанию.

Первоначально для этих целей использовали глицерин, позднее – диметилсульфоксид. Однако эти вещества не подходят для использования при лиофилизации. К настоящему времени разработаны требования к защитным веществам используемых для лиофилизации вакцин и диагностических компонентов. В последнем случае требования несколько снижены.

Ввиду многообразия применяемых криозащитных сред их классифицируют по отношению к мембранному аппарату клетки на проникающие внутрь клетки – эндоцеллюлярные и непроникающие – экзоцеллюлярные. Последние адсорбируются на внешней оболочке клетки и снижают ее проницаемость для воды и биологически активных веществ, замедляют процессы образования внутриклеточного льда, защищают мембраны от механических повреждений растущими кристаллами льда.

Требования, предъявляемые к защитным средам, используемым при лиофилизации вакцин: атоксичность; отсутствие антигенных свойств; адъювантное действие; компоненты среды должны служить структурирующим (опорным) материалом; среда должна ингибировать гидролитические ферменты в биоматериале и обладать антиокислительной активностью.

Практически всем этим требованиям соответствуют следующие вещества: лактоза, сахароза, манитолл, сорбитол, пептон, белковые гидролизаты, декетран желатина, поливинилпиромидон, глутамат натрия, аминокислоты, тиомочевина и другие соединения. Большое значение для повышения защитных свойств среды имеет добавление катионов магния и кальция, оказывающих стабилизирующее влияние на мембранный аппарат клетки.

Средняя скорость замораживания биопрепаратов перед сушкой составляет 0,5–1 °С в минуту. Полное замораживание происходит при температуре минус 32–39 °С. Материал замораживают непосредственно в камере или в специальных замораживателях, откуда его переносят в камеру лиофильной сушки и высушивают по разработанному в экспериментальных условиях графику.

Объем материала должен составлять 20–30 % объема ампулы или флакона либо не должен превышать 0,5–0,6 % столба замороженного биоматериала к диаметру флакона.

После размещения в камере кассет с материалом, подлежащим сушке, ее герметично закрывают, доводят температуру в соответствии с графиком до необходимой и выдерживают 3–6 ч, создают вакуум и начинают подогревать полки либо подавать тепло со скоростью 0,5–1,5 °С в час. С этого времени начинается сублимационная сушка, т. е. удаление паров влаги из замороженного материала при помощи вакуума. Вакуум достигает 5–6 Па, или 0,036–0,046 мм рт. ст.

Собственно сублимацию условно подразделяют на два этапа: сушка при минусовой температуре при повышении температуры на 1–2°С в час; сушка при плюсовой температуре. Иногда эти этапы называют периодом удаления из материала свободной влаги и периодом удаления связанной влаги.

Первый период заканчивается, когда температура материала приближается к нулю градусов. Во втором периоде досушивания температуру поднимают до конечной температуры препарата, равной плюс 25–28 °С. Как правило, продолжительность первого периода значительно больше второго. В первом периоде удаляется до 90 % влаги, во втором остаточная влажность составляет 1–4 %. Признаком окончания второго периода является достижение заданной температуры и удержание ее на этом уровне 1–3 ч, при этом вакуум в системе постоянно поддерживается на минимальном уровне. После окончания сушки прекращают нагрев и выключают вакуум-насос, постепенно уменьшают вакуум, впуская через специальный фильтр стерильный атмосферный воздух либо инертный газ, обеспечивающий более длительное хранение материала при плюсовых температурах.

Сухой материал в ампулах запаивают под вакуумом, во флаконах – герметически укупоривают, предварительно заполнив их инертным газом (аргон, неон, азот).

Качество высушенного биоматериала оценивают по внешнему виду, наличию вакуума, величине остаточной влажности, биологической активности и другим показателям согласно нормативно-технической документации.

Сухой препарат должен иметь вид таблетки, однородной по цвету и структуре. Остаточную влажность определяют по стандартной методике (метод определения влажности сухих биопрепаратов см. ГОСТ 24061-80).

Специфическую активность определяют по конкретной методике в зависимости от вида биопрепарата – титр вируса, концентрация жизнеспособных или споровых форм микроорганизмов, активность ферментов, наличие посторонней микрофлоры, иммуногенная активность и др.

Конвективный метод высушивания

Является самым распространенным в биологической промышленности, на нем основана работа подавляющего большинства сушильных установок. В качестве сушильного агента применяют нагретый воздух, топочные газы или перегретый пар. Сушильный агент передает теплоту материалу, под действием которого из материала удаляется влага в виде пара в окружающую среду. Таким образом, сушильный агент при конвективной сушке является теплоносителем и влагопоглотителем.

Конвективный метод нашел применение в камерных сушильных установках. В таких аппаратах сушка материала производится периодически при атмосферном давлении. Сушилки имеют одну или несколько камер, в которых высушиваемый материал в зависимости от его вида располагается на сетках, противнях, шестах и т. д. и сушится в неподвижном состоянии. Поток нагретого воздуха проходит вдоль высушиваемого продукта и испаряет из него влагу.

Камерными сушильными установками непрерывного действия являются туннельные сушилки, работающие при атмосферном давлении. Камеры представляют собой длинный герметично закрытый тоннель, в котором высушиваемый материал перемещается прямо- или в противотоке сушильного агента, на кюветах или поленте транспортера.

В сушильной технике также используют барабанные сушильные установки, представляющие собой полый цилиндр с внутренней насадкой для непрерывного пересыпания и перемешивания высушиваемого материала, в который подается теплоноситель.

Многие из ранее применявшихся конвективных сушильных установок успешно вытесняются сушилками с использованием псевдоожиженного (кипящего) слоя и его модификаций. Псевдоожиженный (кипящий) слой широко используется для интенсификации процессов сушки сыпучих, хорошо псевдоожижаемых газом материалов. Модификации кипящего слоя связаны, главным образом, с различными механическими побудителями, которые способствуют достижению равномерного и устойчивого псевдоожижения, ликвидации каналообразования и комкования материала, увеличению поверхности фазового контакта и относительной скорости движения фаз. Роль механических побудителей очень велика, они позволяют значительно расширить область эффективного применения кипящего слоя. Появляются аппараты, позволяющие добиться устойчивой гидродинамики: сушилки с виброкипящим слоем, сушилки со слоем инертной насадки, работающие в кипящем и фонтанирующем слоях.

Принцип данного метода состоит в том, что жидкий, гранулированный или пылевидный продукт воздушным потоком взрыхляется и переводится во взвешенное состояние. Необходимый для этого воздушный поток создается вентилятором. Засасываемый снаружи или из рабочего помещения воздух подается сначала в воздушный нагреватель, где нагревается до требуемой температуры. Одновременно производится фильтрование воздуха от находящихся в нем посторонних частиц, затем поток горячего воздуха проходит снизу вверх через находящийся в продуктовой емкости материал и в кратчайший срок отнимает у него влагу. Дно продуктовой емкости представляет собой перфорированную поверхность, которая покрыта металлической сеткой из нержавеющей стали с тончайшими отверстиями. В зависимости от выбора конструкции дна и скорости движения воздушного потока можно увеличивать взвихрение материала. Готовый продукт улавливается циклонами и собирается в сборники. Расположенный над продуктовой емкостью фильтр предотвращает унос потоком воздуха частичек даже тончайшего помола.

Среди сушилок кипящего слоя можно выделить четыре основные группы. К первой группе относятся сушилки, предназначенные для сравнительно хорошо сжижаемых материалов, способных образовать кипящий слой и без механических побудителей. Вместе с тем введение в кипящий слой механических побудителей типа медленно вращающихся мешалок, шнеков и вращающихся решеток позволяет улучшить его структуру, уменьшить канальный проскок, повысить стабильность кипения и интенсифицировать процесс сушки.

Во вторую группу входят сушилки, предназначенные для продуктов, которые без механических побудителей не способны образовать кипящий слой, хотя и являются дисперсными или кусковыми материалами. Введение в слой быстро вращающихся мешалок – дезагрегаторов или измельчителей позволяет создать устойчивый кипящий слой и получить высушенный продукт требуемой дисперсности.

К третьей группе относятся сушилки для паст, супензий и растворов, в которых механический побудитель – инертная насадка (иногда в сочетании с перемешивающими устройствами) является единственным источником создания кипящего слоя.

Четвертую группу составляют вибросушилки, в которых механическим побудителем служит вибрационное колебание корпуса сушилки или погруженные в слой вибрирующие поверхности нагрева.

Широкое внедрение метода сушки во взвешенном слое обусловлено следующими основными достоинствами:

• высокая интенсивность процессов переноса, достигаемая за счет развитой удельной и суммарной поверхностей тепло- и массообмена при непрерывном обновлении активной поверхности фазового контакта и высоких значений коэффициента эффективной теплопроводности и теплоотдачи;
• изотермичность системы, достигаемая в результате интенсивного перемешивания твердой фазы, что предотвращает локальный перегрев частиц;
• сравнительно простое конструктивное оформление аппаратов и возможность регулирования режима их работы;
• возможность создания многоступенчатых аппаратов, что позволяет повысить движущую силу процесса, улучшить равномерность сушки при автономном регулировании температурного режима в отдельных ступенях аппарата (это особенно важно при сушке термолабильных материалов).

К основным недостаткам кипящего слоя следует отнести необходимость ограничения скорости сушильного агента величиной скорости уноса материала, трудность обработки полидисперсных веществ, механическое нарушение целостности частиц (истирание, слипание). Таким образом, при склонности продукта к истиранию резко возрастает пылеобразование и унос продукта. Если материал склонен к образованию конгломератов, нарушается равномерное кипение слоя, возможен локальный перегрев и термоинактивация продукта.

Одним из наиболее эффективных способов конвективной сушки жидких материалов является распылительное высушивание, которое используется главным образом в тех случаях, когда желателен кратковременный контакт продукта с теплоносителем и необходимо производить высушивание непосредственно из раствора. Например, распылительные сушилки применяют для сушки из растворов таких термолабильных продуктов, как экстракты лекарственных растений, ферментные препараты, растворы сахаров, кровезаменители (белоксодержащие растворы) и в ряде других случаев.

Высушивание распылением связано со следующими основными процессами: распыление раствора; смешивание распыленных частиц раствора с нагретым сушильным агентом; тепло- и массообмен между ними; выделение сухих частиц из потока сушильного агента.

Совокупность этих процессов определяет эффективность и технико-экономические показатели метода распыления. Одним из принципиальных моментов распылительной сушки является получение достаточно тонкого и равномерного диспергирования высушиваемого раствора. Средний диаметр капель при сушке распылением обычно составляет 20–60 мкм.

В сушильной технике существует три способа распыления растворов: механическими форсунками, пневматическими форсунками и центробежными дисками, вращающимися с большой скоростью (100-500 об/с).

При сушке распылением большое значение имеет равномерное распределение нагретого воздуха по всей камере. Равномерное распределение газов в сушильной камере и быстрое смешение их с частицами раствора зависит от правильно выбранного ввода воздуха в сушильную камеру.

В современных форсуночных сушилках, работающих по принципу смешанного или параллельного тока, наиболее распространен тангенциальный ввод сушильного агента, чтобы получить закрученный поток воздуха и высушиваемых частиц. Такой ввод обеспечивает хорошее перемешивание газов с частицами раствора. В сушилках с дисковыми распылителями газы вводятся вблизи диска в виде встречного или параллельного потока, что зависит от расположения распылителя.

В современных сушильных установках для очистки воздуха, выходящего из сушильной камеры, используют в основном циклоны, которые позволяют улавливать из воздуха 90–95% высушенного порошка. К преимуществам циклонов следует отнести не только высокую степень очищения газов от пыли, но и то, что улавливаемый порошок мгновенно ссыпается в приемник, избегая тем самым дальнейшего воздействия повышенных температур.

Контактный метод высушивания 

Основывается на передаче теплоты материалу при соприкосновении с горячей поверхностью. В качестве греющего теплоносителя используют чаще всего водяной пар, реже газы и высококипящие жидкости. Поток воздуха (вакуум) при этом способе служит только для удаления водяных паров из сушилки, являясь влагопоглотителем. Поданным литературы, коэффициент теплоотдачи при этом способе значительно выше, чем при конвективной сушке.

Простейшими контактными сушильными аппаратами являются вакуум-сушильные шкафы периодического действия. Такая сушилка представляет собой герметично закрывающуюся камеру, снабженную рядом полок, внутри которых проходит теплоноситель. Высушиваемый материал укладывается непосредственно на полки, либо на съемные противни. Образующиеся при сушке пары отсасываются вакуум-насосом. Будучи очень металлоемкими, эти сушилки в то же время малопроизводительны, что объясняется неподвижностью слоя высушиваемого материала и большей частью недостаточно полным контактом с поверхностью нагрева.

Широкое применение получили вальцовые сушильные установки непрерывного действия различных конструктивных модификаций. В корпусе сушильной установки вращается полый барабан, обогреваемый изнутри тепловым агентом. Исходный жидкий материал непрерывно подается на барабан, где за один неполный оборот последнего высушивается и срезается ножами. Для большей производительности при контактном обезвоживании используются двухвальцовые сушилки.

Сущность терморадиационного метода сушки состоит в том, что теплота материалу передается за счет невидимых тепловых (инфракрасных) лучей. Инфракрасные лучи (ИКЛ) – это лучи с длиной волны 0,77–340 мкм.

По мнению ряда авторов при сушке ИКЛ к материалу подводится тепловой поток в несколько десятков раз больше, чем при конвективном способе, следовательно увеличивается и скорость сушки инфракрасными лучами по сравнению с конвективной, но не пропорционально увеличению теплового потока. Так, например, для биологических препаратов растительного происхождения сушка ИКЛ ускоряется по сравнению с интенсифицированными методами конвективной сушки на 25–95%. Это можно объяснить тем, что скорость сушки зависит не столько от скорости передачи теплоты, сколько от скорости перемещения влаги внутри материала. Но в целях сохранения высоких химико-технологических показателей высушенного продукта применение мощных потоков ИКЛ не рекомендуется.

Для интенсификации терморадиационной сушки необходимо, чтобы ИКЛ проникали в материал на возможно большую глубину, что зависит как от пропускаемой способности материала, так и от длины волны ИКЛ. Чем меньше длина волны, тем больше проникающая способность инфракрасных лучей. Проницаемость материалов зависит, в основном, от толщины слоя и влажности продукта.

При сушке частиц биологических материалов, характеризующихся малой проницаемостью, может произойти быстрая сушка поверхностного слоя, и значительные градиенты температуры и влажности внутри частиц материала приведут к вздутию и растрескиванию материала.

Известно, что при сушке инфракрасными лучами в материале возникают перепады температур, под действием которых влага перемещается по направлению теплового потока вовнутрь материала. Кроме того, влага частично испаряется с поверхности, в результате возрастает градиент влагосодержания, величина которого становится больше, и влага начинает перемещаться к наружной поверхности.

Для материалов, у которых размер частиц больше глубины проникновения инфракрасных лучей, рекомендуется прерывистое облучение. В период прекращения подачи ИКЛ температура на поверхности частиц материала падает вследствие продолжающегося интенсивного испарения, температура внутри частицы больше, чем на поверхности, и влага начинает перемещаться из центральных слоев к поверхностным под действием обоих градиентов: температуры и влагосодержания.

По характеру излучателей инфракрасных лучей различают терморадиационные сушилки с электрическим и газовым обогревом. Сушилки с электрическим обогревом компактны, просты в обращении и эксплуатации, безинерционны. Однако высокий расход электроэнергии и неравномерность сушки ограничивают их применение.

Наиболее широко используются на практике терморадиационные сушилки с газовыми панельными излучателями.

При сушке токами высокой частоты (частота колебаний 10–3000 МГц) органический материал помещается между обкладками конденсатора, к которым подается электрический ток высокой частоты. Продукты биологического происхождения представляют собой диэлектрики, имеющие некоторую проводимость, т. е. обладающие свойствами полупроводников. В состав органических материалов входят ионы электролитов, электроны, полярные и неполярные молекулы диэлектриков. Неполярные молекулы состоят из жестких упругих диполей. Полярные молекулы с постоянным дипольным моментом ориентируются в электрическом поле. Под действием переменного электрического поля высокой частоты происходит регулируемый нагрев материала.

Обкладки конденсатора имеют противоположные заряды, поэтому электроны и ионы перемещаются внутри материала к той или иной обкладке. При смене заряда на обкладках они перемещаются в противоположных направлениях, в результате чего неизбежно возникает трение с выделением теплоты. Диполи в переменном электрическом поле будут колебаться то в одну, то в другую сторону, стремясь занять положение относительно переменного поля. В результате таких колебаний диполей также возникает молекулярное трение с выделением теплоты. В полярных молекулах, состоящих из упругих диполей, кроме изменений ориентации молекул возможны и смещения одних частей молекулы относительно других. Возникающий при этом эффект деформации также сопровождается выделением теплоты за счет трения.

Таким образом, энергия электромагнитных волн, затрачиваемая на преодоление этих трений, будет переходить в теплоту.

В электрическом поле высокой частоты нагрев частиц органического материала осуществляется за доли секунды. Поверхностные слои материала теряют часть теплоты вследствие тепло- и влагообмена с окружающей средой, поэтому температура материала будет выше внутри, чем снаружи. Под действием температурного градиента влага изнутри перемещается к поверхности частиц.

Преимущества сушки токами высокой частоты по сравнению с конвективной и контактной состоят в возможности регулирования и поддержания определенной температуры внутри материала и интенсификации процесса. Однако большие затраты электроэнергии, сложное оборудование и обслуживание, повышенные требования техники безопасности ограничивают применение токов высокой частоты.

В настоящее время для сушки термолабильных препаратов, кроме рассмотренных выше методов, применяют их различные комбинации, которые позволяют достичь высокого качества получаемой продукции, повышения производительности и экономичности процесса, уменьшения трудозатрат. Примерами комбинированных способов сушки могут служить распылительно-сублимационное высушивание, контактно-сорбционное обезвоживание.