Схемы идентификации отличаются от схем классификации, хотя внешне они могут быть сходными. Схема идентификации для данной группы организмов может быть разработана только после того, как эта группа будет классифицирована (т. е. признана как отличная от других организмов). Схема основана на одном или более признаках либо на совокупности признаков, которыми все организмы данной группы обладают, а других групп – нет. Часто это совсем не те признаки, на которых построена классификация. Например, классификация может быть основана на данных гибридизации ДНК/ДНК, в то время как идентификация – на фенотипическом признаке, хорошо коррелирующем с генетическими особенностями. В общем, для построения схемы идентификации выбирают такие признаки, которые легко определить, тогда как признаки, используемые для классификации, часто требуют применения сложных методов (например, если это гомология ДНК). Схема идентификации должна включать малое число признаков, в отличие от схемы классификации, для которой часто используют большое число признаков, как например, в нумерической таксономии. Такие идеальные качества схемы идентификации не всегда достижимы, особенно в отношении тех родов и видов, для характеристики которых не подходят традиционные физиологические или биохимические тесты. В этих случаях для точного определения могут потребоваться весьма сложные процедуры, такие как электрофорез клеточных белков в полиакриламидном геле, анализ состава липидов, гибридизация нуклеиновых кислот.

Серологические реакции, обычно имеющие ограниченное применение в классификации, часто приобретают огромное значение для идентификации. Реакция агглютинации на стекле, иммунофлуоресцентные методики и другие серологические методы позволяют легко и быстро проводить анализы и обычно высоко специфичны, благодаря чему обеспечивают возможность быстрой предварительной идентификации. Специфичность этих методов, однако, не абсолютная, и обычно результаты идентификации необходимо подтверждать с помощью дополнительных физиологических или биохимических тестов.

Идентификация многих родов и видов не может быть основана всего лишь на немногих тестах, но только на их полном наборе. Одним из примеров этого служит семейство Enterobacteriaceae. Чтобы не было необходимости инокулироватъ большое количество разлитых по пробиркам сред, разработаны и поступают в продажу разнообразные наборы для удобного и быстрого проведения многочисленных тестов. Такие наборы созданы для идентификации различных таксонов, в том числе для микроорганизмов, имеющих медицинское значение. Хорошая сводка ряда подобных систем идентификации приведена в работе L. Amato et alM 1991, Substrate profile systems for the identification of bacteria and yeasts by rapid and automated approaches, In; Manual of Clinical Microbiology: Balows, Hausler, Herrmann, Isenberg, and Shadomy (Eds.), 5th Ed., American Society for Microbiology, Washington, D. С. Разработка такого рода тестовых систем продолжается. К каждой системе фирма-производитель прилагает графики, таблицы, системы кодирования, компьютерные базы данных и перечни признаков.

Новейший способ идентификации бактерий – это применение генетических зондов. Метод основан на определении специфического участка молекулы ДНК данного организма. Зонд представляет собой небольшой отрезок ДНК, нуклеотидная последовательность которого уникальна для данного вида или рода бактерий, В целях идентификации исследуют реакцию меченного флуоресцентным красителем, радиоизотопом или биотипом зонда с денатурированной ДНК исследуемого организма. Если ДНК организма содержит комплементарную зонду последовательность, произойдет ее связывание с ДНК зонда за счет спаривания комплементарных оснований. К настоящему времени имеются флуоресцентные зонды к генам рибосомных РНК, позволяющие проводить определение живых микроорганизмов под микроскопом.

Необходимость применения стандартизованных методик тестов

Одна из трудностей при разработке схем идентификаций состоит в том, что результаты тестов для установления тех или иных признаков могут сильно зависеть от величины инокулята, температуры и длительности инкубации, состава среды, соотношения поверхность:объем у сосуда, в котором проводят тест, и, наконец, от критериев, используемых для оценки реакции как положительной или отрицательной. Из-за этого результаты тестирования, полученные в двух разных лабораториях, часто не совпадают точно, тогда как в каждой из них получают хорошо воспроизводимые результаты. Поэтому слепое применение схемы идентификации без учета конкретных условий, использованных теми, кто ее разрабатывал (к сожалению, эти условия не всегда указывают), может привести к ошибке, В идеале желательно было бы стандартизировать условия для тестирования различных признаков, однако это легче сказать, чем сделать, особенно на международном уровне. Некоторую надежду дает возможность использования поступающих в продажу готовых тестовых систем, которые проходят строгую проверку качества сред и реагентов, однако, к сожалению, пока нет ни одного общепризнанного готового набора тестов для того или иного таксона. Поэтому при использовании схемы идентификации лучше всегда параллельно ставить для сравнения тесты со штаммами, которые определены абсолютно точно (типовые или ссылочные штаммы, имеющиеся в национальных коллекциях культур), чтобы не сомневаться, что схема дает достоверные результаты в вашей лаборатории. Весьма важно сравнить признаки изолята, предположительно относящегося к данному виду, с признаками типового штамма или установленного для этого вида ссылочного штамма. Типовые штаммы видов бактерий приведены в следующих справочных изданиях:

• Skerman, V. В. D., V. McGowan, and P. Н. А. Sneath. 1989. Approved Lists of Bacterial Names. Amended edition. American Society for Microbiology, Washington, D. C.
• Moore, W. E. G. and V. H. Moore, 1989. Approved Lists of Bacterial Names (1 January 1980 to January 1989). American Society for Microbiology, Washington, D. С. Это перечень опубликованных в International Journal of Systematic Bacteriology изменений номенклатуры бактерий и дрожжей.
• Списки опубликований, признанных действительными, для новых названий и новых комбинаций, ранее эффективно опубликованных в иных изданиях нежели «International Journal of Systematic Bacteriology». Эти списки систематически публикует «International- Journal of Systematic Bacteriology».
• Статьи с описанием новых видов, публикуемые в выпусках «International Journal of Systematic Bacteriology».
• Перечень коллекций культур, в которых можно получить типовые штаммы, приведен в «Bergey's Manual of Systematic Bacteriology».

Необходимость разграничения «положительных» и «отрицательных» реакций

Некоторые тесты основаны на признаках, которые связаны с плазмидами или фагами. Такие признаки могут быть высокомутабильными и поэтому малопригодными для целей идентификации. Даже тесты, основанные на немутабильных признаках, могут быть недостаточно пригодными для схем идентификации, поскольку не дают хорошей воспроизводимости результатов (как, например, тест на каталазу, тест на оксидазу, реакция Фогеса-Проскауэра, тест на разжижение желатины). В идеале тест должен давать воспроизводимые результаты, однозначно положительные или отрицательные, без двусмысленных ответов. На самом деле таких тестов может не быть. Окраска организма по Граму может быть «грамвариабельной»; присутствие эндоспор у штамма, образующего их лишь в небольшом количестве, бывает трудно определить путем окрашивания или с помощью теста на устойчивость к нагреванию; при незначительном образовании кислоты из сахара возможен ошибочный вывод об отсутствии кислотообразования; ответ «слабый рост» трудноотличим от результата «отсутствие роста». Между тем, точное, хотя и произвольное определение, что есть «положительный» ответ и что есть «отрицательный», часто очень важно для того, чтобы тест был полезен в схеме идентификации.

Необходимость работы с чистыми культурами

Лишь немногие бактерии имеют настолько характерные морфологические особенности, что их можно идентифицировать без выделения. В большинстве же случаев, прежде чем пытаться определить организм по фенотипическим признакам, необходимо получить его чистую культуру. Новейшие методы идентификации при помощи генных зондов, часто с амплификацией в полимеразной цепной реакции, можно применять на смешанных популяциях. В настоящее время, однако, применение этих методов ограничено видами, важными для медицины.

Однократный отбор колонии с агаровой пластинки не обеспечивает чистоту культуры. Это особенно справедливо в случае использования селективных сред: часто в колонии или рядом с ней могут присутствовать жизнеспособные, но не растущие на этих средах сопутствующие организмы, которые будут пересеяны вместе с выделяемым организмом. По этой причине для завершающего этапа выделения предпочтительны неселективные среды, поскольку они позволят сопутствующим организмам образовать видимые колонии. Даже при использовании неселективных сред не следует слишком скоро пересевать по виду вполне четкие колонии; некоторые сопутствующие микроорганизмы могут быть медленнорастущими и давать видимые колонии только при длительной инкубации. Дополнительные сложности возникают, если бактерии окружены внеклеточной слизью либо образуют сеть из цепочек или нитей; в эти компоненты или структуры часто заключены сопутствующие организмы, которые трудно отделить. Так, сопутствующие организмы часто проникают в гелеобразные чехлы, окружающие клетки цианобактерий, что очень затрудняет получение чистых культур.

Обычно колонии из клеток чистой культуры, высеянной на плотную среду, похожи одна на другую, что и служит доказательством чистоты культуры. Хотя в общем это верно, существуют исключения, например в случае S → R-вариантов, а также вариантов, связанных с образованием капсул и наличием либо отсутствием пигментации. Подобные варианты можно отобрать с помощью определенных сред, температуры или иных условий культивирования. Другой критерий чистоты культуры – это морфология: для чистой культуры обычно характерна высокая степень морфологического сходства клеток в окрашенных или влажных препаратах. Однако и здесь бывают исключения, что зависит от возраста культуры, используемой среды или других условий роста. Примерами служат образование кокковидных тел, цист и спор, а также плеоморфизм. Так, при исследовании культуры морской спириллы в жидкой среде через двое или трое суток инкубации можно придти к выводу, что культура сильно загрязнена кокками, если не знать, что эта спирилла после активного роста часто образует тонкостенные кокковидные формы.

Общие правила предосторожности при идентификации бактерий

Ниже приведены с некоторыми изменениями общие правила идентификации бактерий, как они изложены в 8-м издании этого определителя (S. Т. Cowan, J. Liston «The Mechanism of Identification»):
1. Удостоверьтесь, что культура чистая.
2. Переходите от общих категорий к более мелкой, специфической категории организма.
3. Используйте всю доступную вам информацию для сужения круга возможностей.
4. На каждом этапе работы руководствуйтесь здравым смыслом.
5. Используйте для идентификации минимальное количество тестов.
6. Сравните выделенный вами организм с типовым штаммом или ссылочным штаммом предполагаемого таксона, чтобы убедиться в пригодности используемой схемы идентификации в условиях вашей лаборатории.

Если не удастся идентифицировать и золят с помощью данного определителя, что вполне возможно, не нужно ни впадать в отчаяние, ни заключать сразу же, что обнаружен новый род или вид. Множество проблем в классификации микробов возникло в результате подобных скороспелых выводов.

Если вам не удалось идентифицировать выделенный изолят, проверьте:
а) его чистоту
б) соответствие использованных тестов
в) адекватность методов
г) правильность использования ключей и таблиц руководства.

Следует отметить, что чаше всего причиной неверной идентификации бактерий бывают ошибки в определении формы, способности к движению и окраски по Граму. В большинстве случаев нетрудно установить род, к которому относится организм, однако определить вид или разновидность иногда невозможно без помощи специалиста по данной группе микроорганизмов.

В то же время вполне возможно, что вы действительно выделили новый род или вид. Сопоставление данного и предыдущего изданий этогоопределителя показывает, что в новом добавлен целый ряд родов и видов. Примером могут служить такие роды как Oligella, Hydrogenophaga, Acidomonas, Deteya, Chryseomonas и др. Несомненно, в природе существует множество бактерий, которые пока не классифицированы и поэтому не могут быть идентифицированы по существующим схемам. Все же, прежде чем описывать новый таксон и давать ему название, нужно очень твердо убедиться, что это действительно новый таксон» а не ошибка идентификации.